Perfil imunoquímico das vacinas comerciais deD. pteronyssinus para imunoterapia*

Immunochemical profile of commercial D. pteronyssinus vaccines for immunotherapy

Ernesto A. Taketomi1, Deise A. O. Silva2, Jair P. Cunha Jr3, Erika A. L. Pereira4, Mônica C. Sopelete4, Foued S. Espíndola5, Walfrido Antunes6

* Trabalho vencedor do Prêmio Oswaldo Seabra no XXVII Congresso Brasileiro de Alergia e Imunopatologia

1 - Professor Titular de Imunologia e Coordenador do Pro-grama de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitolo-gia/UFU; 2 - Pesquisadora do Laboratório de Imunolo-gia/UFU; 3 - Professor Substituto da Disciplina de Imuno-logia e Pós-Graduando em Genética e Bioquímica (Douto-rado)/UFU; 4 - Pós-Graduandas (Mestrado) em Imunologia e Parasitologia Aplicadas/UFU; 5 - Professor Titular de Bioquímica/UFU; 6 - Médico Especialista em Alergia e Imunologia Clínica, Recife, PE.

 

 

Resumo

Objetivo: Analisar diferentes vacinas de alérge-nos contendo D. pteronyssinus comercialmente dispo-níveis com a finalidade de caracterizar o perfil imuno-químico das mesmas e levar ao conhecimento dos mé-dicos especialistas que utilizam estas vacinas como estratégia terapêutica em doenças alérgicas.

Métodos: Dosagem de proteína e polissacáride, eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), quantificação dos alérgenos Der p 1, Der p 2 e Der f 1 por ELISA e imunorreatividade alergênica para detec-ção de IgE específica por ELISA e Immunoblotting foram realizados.

Resultados: Observou-se grande heterogeneidade das vacinas em relação à concentração protéica e per-fil eletroforético. As vacinas 2, 3 e 4 apresentaram bandas protéicas em SDS-PAGE, em número e inten-sidade variáveis. Somente na vacina 2 foram detecta-dos valores extremamente altos de Der p 1 (409,9 mg/ml) e Der p 2 (210,7 mg/ml). Imunorreatividade alergênica para IgE foi observada somente em três amostras de vacinas, com níveis de IgE significativos e comparáveis detectados apenas nas vacinas 2 e 3. Por outro lado, immunoblotting IgE demonstrou pa-drão de reconhecimento antigênico somente com a va-cina 2, denotando a presença de quantidades significa-tivas de frações alergênicas na referida vacina, como comprovado pelos resultados obtidos de concentração protéica, perfil eletroforético e dosagem de alérgenos principais (Der p 1 e Der p 2).

Conclusões: Os resultados indicam que as vacinas de D. pteronyssinus analisadas apresentam doses dos respectivos alérgenos muito aquém das doses compro-vadamente efetivas recomendadas. Assim, as vacinas alergênicas devem ser melhor caracterizadas quanto à potência total e ao teor do alérgeno principal, antes de serem disponibilizadas no mercado.

Rev. bras. alerg. imunopatol. 2001; 24(5):173-182 composição alergênica, Der p 1, Der p 2, D. pteronys-sinus, imunoterapia, vacina alergênica



Abstract

Objective: To analyze different commercially available allergen vaccines with D. pteronyssinus in order to characterize the immunochemical profile of the vaccines and also to provide information to certi-fied allergists that employ them as a therapeutical strategy in allergic diseases.

Methods: Protein and polyssacharide measure-ments, SDS-PAGE electrophoresis, Der p 1, Der p 2, and Der f 1 allergen quantitation by ELISA and aller-gen immunoreactivity for the detection of specific IgE by ELISA and immunoblotting were performed.

Results: A great heterogeneity of the vaccines was observed with regard to protein concentration and electrophoretic profile. The vaccines 2, 3, and 4 show-ed protein bands in SDS-PAGE with variable number and intensity. High values of Der p 1 (409.9 mg/ml) and Der p 2 (210.7 mg/ml) were only detected in the vaccine 2. Allergen immunoreactivity for IgE was observed in three vaccine samples, with significant and comparable IgE levels in the vaccines 2 and 3. On the other hand, immunoblotting IgE revealed antigen recognition pattern only with the vaccine 2, indicating the presence of significant amounts of allergenic frac-tions in that vaccine as confirmed by results obtained in its protein concentration, electrophoretic profile, and major allergen content (Der p 1 and Der p 2).

Conclusions: The results indicate that the analyzed D. pteronyssinus vaccines present allergen doses be-low what has been proved to be effective. Thus, aller-gen vaccines should be better characterized in relation to total potency and major allergen content before they have become commercially available.  

     Rev. bras. alerg. imunopatol. 2001; 24(5):173-182 allergen content, allergen vaccine, Der p 1, Der p 2, D. pteronyssinus, immunotherapy.

 


Introdução

    A imunoterapia (IT) específica com alérgenos é largamente utilizada pela maioria de alergistas do mundo inteiro, embora muitos especialistas argumentam que a comprovação científica existe apenas para poucos alérgenos como pólens, áca-ros da poeira domiciliar e veneno de abelha1. A IT está indicada para pacientes atópicos que apre-sentam mecanismos envolvendo a produção de anticorpos da classe IgE específicos a alérgenos clinicamente relevantes2.

    A IT consiste em injetar quantidades crescen-tes de alérgenos que causam e/ou provocam doen-ças alérgicas em pacientes com a finalidade de re-duzir a sensibilidade aos mesmos. Alguns estudos bem controlados têm provado a utilidade de tal tratamento, embora efeitos alérgicos adversos e pobre eficácia, às vezes, devido ao uso de produ-tos inapropriados em pacientes mal selecionados, têm levado a críticas da terapia e algumas restri-ções de sua utilização, particularmente na Euro-pa3.

    A qualidade da vacina de alérgenos é crítica para a imunoterapia. O emprego de vacinas bem caracterizadas e com potência padronizada é de suma importância para a definição do esquema te-rapêutico com o intuito de obter melhor eficácia e menor risco de anafilaxia. A padronização de va-cinas de alérgenos se baseia na detecção in vivo (testes cutâneos) e in vitro (RAST, ELISA) de anticorpos IgE aos alérgenos. Além disso, a com-posição da vacina pode ser determinada por méto-dos como a focalização isoelétrica, eletroforese em SDS-PAGE, immunoblotting IgE e radioimu-noeletroforese cruzada (CRIE)2.

    Atualmente, a maioria das vacinas de alérge-nos disponível comercialmente é baseada em ex-tratos protéicos derivados de fontes naturais. Es-tas proteínas podem ser parcialmente purificadas ou quimicamente modificadas; contudo, as prepa-rações utilizadas retêm tanto os epitopos reconhe-cidos por células B como células T4.

    Estudos sobre exposição alergênica têm de-monstrado que os ácaros Dermatophagoides pte-ronyssinus e D. farinae constituem a principal fonte de alérgenos da poeira domiciliar, particu-larmente Der p 1, Der p 2 e Der f 15,6. Estes alér-genos são potentes imunógenos que induzem res-postas de células T e anticorpos das classes IgE e IgG específicos em indivíduos alérgicos a ácaros da poeira domiciliar7.

    Recentemente foram elaboradas diretrizes in-ternacionais para a IT com alérgenos com a parti-cipação de inúmeros especialistas de várias partes do mundo com a finalidade de obter melhor en-tendimento e maior segurança desse tipo de tra-tamento2.

    Desta forma, o presente estudo objetivou ana-lisar diferentes vacinas de alérgenos de D. ptero-nyssinus comercialmente disponíveis com a fina-lidade de caracterizar o perfil imunoquímico das mesmas e levar ao conhecimento dos médicos especialistas que utilizam estas vacinas como estratégia terapêutica em doenças alérgicas. 

Material e Métodos 

Vacinas de alérgenos de D. pteronyssinus para imunoterapia

Foram analisadas 8 vacinas de alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus comercialmente disponíveis para imunoterapia, identificadas por números de 1 a 8, transferidas em volumes de 1 ml para um mesmo tipo de frasco, de forma que os fornecedores desconheciam esta análise e os pesquisadores desconheciam a fonte das respec-tivas vacinas.

Todas as amostras foram submetidas a vários parâmetros de análise.

Dosagem de Proteína e de Polissacáride

     As concentrações protéicas de todas as amos-tras foram determinadas por dois métodos: Low-ry et al8 e Bradford9, utilizando soro albumina bovina (Sigma Chemical Co.) como proteína de referência para a curva padrão. A concentração de polissacáride foi realizada segundo a técnica de antrona10, utilizando dextrose (Sigma Chemical Co.) como polissacáride de referência para a cur-va padrão.

ELISA para quantificação dos níveis de alér-genos de ácaros

    Alérgenos de Dermatophagoides pteronyssi-nus (Der p 1 e Der p 2) e de D. farinae (Der f 1) foram mensurados por ELISA tipo sandwich co-mo descrito por Luczynska et al.11, com modifica-ções. Em resumo, microplacas de poliestireno (Immulon 2Ò, Dynatech Laboratories Inc., Chan-tilly, VA, USA) foram sensibilizadas separada-mente com anticorpos monoclonais de camun-dongos anti-Der p 1 (clone 5H8), anti-Der p 2 (clone 1D8) e anti-Der f 1 (clone 6A8) na concen-tração protéica de 1mg/poço em tampão carbonato 0,06M, pH 9,6 por 18 horas a 4 oC. As placas fo-ram lavadas com solução salina tamponada com fosfato 0,01M, pH 7,2 (PBS) contendo Tween 20 a 0,05% (PBS-T) e bloqueadas com PBS-T acres-cido de soroalbumina bovina a 1% (PBS-T-BSA) por 1 h em temperatura ambiente (TA). Etapas subseqüentes foram realizadas utilizando PBS-T-BSA como diluente e lavagens em PBS-T foram efetuadas entre as etapas da reação. As placas fo-ram incubadas com amostras das vacinas de alér-genos (não diluídas, 1:5 e 1:25) por 1 h em TA. Subseqüentemente, foram adicionados anticorpos biotinilados anti-alérgenos de Dermatophagoides do grupo 1 (clone 4C1; 1:1000) e do grupo 2 (clo-ne 7A1; 1:3000), incubados por 1 h em TA e o conjugado estreptavidina-peroxidade (Sigma Chemical Co., St. Louis., USA) diluída 1:1000 foi incubada por 30 min em TA. O ensaio foi revelado pela adição de substrato enzimático (ABTS a 0,01 M em tampão citrato-fosfato a 0,07 M, pH 4,2 e H2O2 a 0,03%). A leitura foi realiza-da em leitor de microplacas ELISA (Titertek Multiskan, Flow Laboratories, USA) a 405 nm. Padrões de referência contendo níveis conhecidos de cada alérgeno foram incluídos em cada placa, em duplicata, para obter curvas controles varian-do de 125 a 0,5 ng/ml. As amostras das vacinas de alérgenos que apresentaram valores de absor-vância extrapolados acima da curva padrão dos respectivos alérgenos, foram novamente testadas em diluições maiores (1:125: 1:500, 1: 1000; 1:2000; 1:5000 e 1:10.000).

ELISA para detecção de anticorpos IgE espe-cíficos a alérgenos

Ensaios imunoenzimáticos ELISA para detec-ção de IgE específica foram realizados para ava-liar a imunorreatividade das diferentes vacinas de alérgenos de D. pteronyssinus, segundo Mastran-drea et al12, com modificações.

    Microplacas de poliestireno de alta afinidade (Corning Laboratories Inc., USA) foram sensibili-zadas (50 ml/poço) com as respectivas vacinas de D. pteronyssinus em diferentes diluições (1:5, 1:10 e 1:20) em tampão carbonato 0,06M, pH 9,6 por 18 horas a 4 oC. Paralelamente, os poços fo-ram sensibilizados com extrato total de D. farinae (Bayer Corporation, USA) na diluição de 1/20 (1500 AU/ml) para realização da curva padrão. Em seguida, as placas foram lavadas e bloquea-das como anteriormente descrito e posteriormente incubadas com amostras de soros controles positi-vos (pacientes asmáticos IgE positivos a D. ptero-nyssinus) e negativos (indivíduos controles não atópicos), em duplicata, na diluição de 1:2 em PBS-T-BSA por 2 h a 37 oC. Após novas lava-gens, foi adicionado o anticorpo secundário IgG de cabra anti-IgE humana biotinilado (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., EUA) a 1:1000 em PBS-T-BSA por 1 h a 37 oC. As etapas subse-qüentes (adição de conjugado estreptavidina-pe-roxidase e substrato enzimático) foram similares às descritas em ELISA para quantificação de alér-genos. Paralelamente, foram realizadas curvas controles utilizando um pool de soros de pacien-tes alérgicos a ácaros (UVA 87/01) contendo 1000 unidades RAST (RU)/ml de IgE anti-D. fa-rinae. A curva controle variou de 250 a 0,5 RU/ml, em diluições duplas seriadas em PBS-T-BSA, em duplicata. Resultados foram expressos como unidades ELISA por mililitro (EU/ml) comparando-se com a curva controle (1 RU/ml foi arbitrariamente considerada equivalente a 1 EU/ml, segundo Silva et al13)

Eletroforese em gel de poliacrilamida com do-decil sulfato de sódio (SDS-PAGE)

     Para evidenciar os principais polipeptídeos de cada vacina de D. pteronyssinus, as amostras fo-ram submetidas a eletroforese vertical em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), segundo Laemmli14. Inicialmente, foi empregado gel gradiente de acrilamida na con-centração de 5-22% e com gel de empilhamento de 5%. Todas as amostras foram eletroforetica-mente separadas em condições redutoras (2-b-mercaptoetanol a 10%) e não redutoras. As amos-tras foram preparadas para eletroforese por 3 min a 100 oC em tampão de amostra (sacarose 2%, SDS 1%, Tris 31 mM pH 6,8, azul de bromofenol 0,02%), sendo aplicados 10 mL de cada amostra por poço. Paralelamente, foi aplicado padrão de peso molecular (Rainbow Markers, Amersham Life Science) variando de 14,3 a 220 kDa. Poste-riormente, SDS-PAGE na concentração de 14% foi utilizado para melhor visualização e resolução das bandas protéicas na faixa de 10 a 97 kDa, sob as mesmas condições acima descritas. Após a ele-troforese, os géis foram submetidos à coloração com nitrato de prata segundo o método de Blum et al15. A imagem do gel, ainda hidratado, foi di-gitalizada mediante uso de scanner.

Immunoblotting IgE

     Após a eletroforese, as frações protéicas foram transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,4 mm de acordo com o método de Towbin et al16, utilizando sistema semi-úmido de transferên-cia (LKB Multiphor Novablot II, Pharmacia UK) por 2 h a 120 mA. O sucesso da transferência foi confirmado pela visualização das frações pré-co-radas do padrão de peso molecular sobre a mem-brana de nitrocelulose. Tiras de nitrocelulose de 3mm de largura foram bloqueadas em PBS-T contendo 5% de leite desnatado (Molico, Nestlé) por 2 h em TA e a seguir incubadas por 24 h a 4oC com anticorpos primários consistindo de amostras de soros controles positivos (pacientes asmáticos IgE positivos a D. pteronyssinus) e ne-gativos (indivíduos controles não atópicos), na diluição de 1:5 em PBS-T contendo leite molico a 1% (PBS-T-M). Após lavagens (6 x 5 min)com PBS-T-M, as tiras foram incubadas com anticor-po secundário anti-IgE humana biotinilado (Kir-kegaard & Perry Laboratories Inc., EUA) a 1:500 em PBS-T-M por 20 h a 4oC. Após novas lava-gens, as tiras foram incubadas por 2 h em TA com estreptavidina-peroxidase (Sigma Chemical Co.) a 1:500 em PBS-T-M. Após lavagens finais, as bandas protéicas reativas foram visualizadas pela adição de 5 mg do substrato enzimático 3,3’-tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) em 10 ml de PBS com 1% de H2O2. A reação foi interrompida por lavagens em água destilada e os pesos moleculares das bandas protéicas foram estimados segundo o padrão de peso molecular de referência.

Análise estatística

     Análise estatística consistiu na determinação de médias geométricas (gm) com intervalo de confiança (IC) de 95% dos valores de IgE especí-ficos obtidos na análise de imunorreatividade alergênica das diferentes vacinas de alérgenos. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisti-camente significativos.

Resultados

    A tabela 1 demonstra os resultados da dosa-gem de proteína e de polissacáride determinada em oito vacinas de alérgenos de D. pteronyssinus para imunoterapia pelos métodos de Bradford9e Martirani10, respectivamente. A dosagem de pro-teína também foi realizada pelo método de Lowry et al8, porém os resultados revelaram valores ex-tremamente altos, sugerindo a presença de subs-tâncias interferentes (dados não mostrados). Somente as vacinas 2 e 6 apresentaram valores expressivos de conteúdo protéico (1,82 e 7,70 mg/ml, respectivamente) em relação às demais vacinas. As vacinas 1, 5, 7 e 8 revelaram valores extremamente baixos ou em níveis não detectá-veis. Quanto ao conteúdo de polissacárides, a vacina 6 apresentou o valor mais alto (9 mg/ml), cerca de 11 vezes superior à vacina 2 (0,81 mg/ ml) e 15 vezes superior à vacina 7 (0,59 mg/ml). As demais amostras apresentaram níveis bem baixos ou não detectáveis.

Tabela 1 - Dosagens de proteína, polissacáride e alérgenos de D. pteronyssinus (Der p 1 e Der p 2) e de D. farinae (Der f 1) determinadas em oito vacinas de alérgenos contendo D. pteronyssinus para imunoterapia.

Vacinas

Proteínaa

(mg/ml)

Polissacárideb

(mg/ml)

Alérgenosc

Der p 1 (µg/ml)

Der p 2 (µg/ml)

Der f 1 (µg/ml)

1

0,03

nd

nd

nd

nd

2

1,82

0,81

409,9

210,7

nd

3

0,38

nd

0,11

0,63

nd

4

0,13

0,09

nd

nd

nd

5

nd

nd

nd

nd

nd

6

7,70

9,00

nd

nd

nd

7

0,01

0,59

0,21

0,01

0,13

8

nd

nd

nd

nd

nd

              a Método de Bradford9                                

              b Método de Antrona10

              c ELISA tipo sandwich11

                nd: não detectado

    Níveis dos alérgenos de D. pteronyssinus (Der p 1 e Der p 2) e de D. farinae (Der f 1) determi-nados por ELISA tipo sandwich11 nas oito amos-tras de vacinas estão também demonstrados na tabela 1. Somente na vacina 2 foram detectados valores extremamente altos de Der p 1 e Der p 2 (409,9 e 210,7 mg/ml, respectivamente). As vaci-nas 3 e 7 apresentaram conteúdo de Der p 1 (0,11 e 0,21 mg/ml, respectivamente) aproximadamente 4000 e 2000 vezes inferior à vacina 2. Em relação ao conteúdo de Der p 2 foram detectados níveis de 0,63 e 0,01 mg/ml, respectivamente para os ex-tratos 3 e 7, valores cerca de 330 e 20.000 vezes inferiores aos obtidos para o extrato 2. Não foram encontrados níveis detectáveis de Der p 1 e Der p 2 nas demais vacinas. Em contraste, nenhuma va-cina apresentou níveis detectáveis do alérgeno Der f 1, exceto a vacina 7, embora em baixos níveis (0,13 mg/ml).

As amostras de vacinas foram analisados por ELISA quanto à imunorreatividade alergênica pa-ra detecção de anticorpos IgE específicos. Como observado na tabela 2, níveis de IgE específica nos soros controles positivos foram demonstrados apenas com as vacinas 2 (mg: 199,5 EU/ml; 95% IC: 118,0 – 337,3 EU/ml), 3 (mg: 118,3 EU/ml; 95% IC: 24,8 – 564,9 EU/ml), e 7 (mg: 17,3 EU/ml; 95% IC: 16,1 – 18,4 EU/ml), sendo que as vacinas 2 e 3 revelaram níveis significativa-mente superiores à vacina 7 (p<0,05). As vacinas restantes falharam em detectar IgE específica no soro de pacientes asmáticos IgE positivos a D. pteronyssinus. Por outro lado, todas as vacinas mostraram-se não reativas para soros controles negativos de indivíduos não atópicos.

A figura 1 representa o perfil eletroforético das oito amostras de vacinas de D. pteronyssinus utilizando-se SDS-PAGE a 14%. Somente nas amostras de vacinas 2, 3 e 4 foram visualizadas frações protéicas coradas pelo nitrato de prata com pesos moleculares (PM) na faixa de 10 a 97 kDa. Na vacina 2, inúmeras bandas com PM esti-mados de 12, 14, 17, 19, 22, 25, 28, 32, 34, 41, 46, 54, 60, 66, 80 e 97 kDa foram identificadas. Na vacina 3, uma forte banda protéica na faixa de 54-60 kDa pôde ser identificada, além de duas outras frações (48 e 97 kDa) menos intensamente coradas. A vacina 4 revelou somente uma única banda de aproximadamente 14 kDa. Por outro la-do, não foram visualizadas bandas protéicas em outras amostras de vacina, sendo que a vacina 6 revelou forte marcação sem definição de bandas.

Tabela 2 - Análise da imunorreatividade alergênica para detecção de IgE específica em oito vacinas de alérgenos contendo D. pteronyssinus por ELISA.

Vacinas

IgE específica a D. pteronyssinus 

mg (IC)a

Soros Controles Positivosb

Soros Controles Negativosc

1

nd

nd

2

199,5 (118,0 - 337,3)

nd

3

118,3 (24,8 - 564,9)

nd

4

nd

nd

5

nd

nd

6

nd

nd

7

17,3 (16,1 - 18,4)

nd

8

nd

nd

a-  Média geométrica (mg) e intervalo de confiança (IC) de 95% dos níveis de IgE específica em EU/ml.

b - Soros de pacientes asmáticos IgE positivos a D. pteronyssinus confirmados por testes cutâneos e ELISA (n=3). 

c-  Soros de indivíduos controles não atópicos confirmados por testes cutâneos e ELISA (n=3).

nd: não detectado

Figura 1 - Perfil eletroforético de oito vacinas de alérgenos contendo D. pteronyssinus em SDS-PAGE a 14%. O gel foi corado pelo método de nitrato de prata. Linhas 1 a 8 indicam as respectivas vacinas. Linha 0 representa padrão de peso molecular (kDa).

    Immunoblotting IgE foi realizado somente pa-ra as amostras de vacinas 2, 3 e 7, considerando os resultados obtidos por ELISA para a detecção dos alérgenos Der p 1 e Der p 2 (tabela 1) e a de-tecção de IgE específica na análise de imunorrea-tividade alergênica (tabela 2). Como demonstrado na figura 2, padrão de reconhecimento antigênico por anticorpos IgE específicos foi obtido somente com a vacina 2 (linhas 1, 2 e 3). O principal antí-geno imunodominante que reagiu com anticorpos IgE presentes nos três soros de pacientes asmáti-cos foi a fração protéica de 14 kDa. Além deste, outros componentes antigênicos (17-19, 25, 28-30, 46, 54-60, 66, 80 e 97 kDa) foram identifica-dos nos diferentes soros de pacientes com asma atópica. Entre os indívíduos não atópicos (fig. 2, linhas 4, 5 e 6), nenhuma reatividade de IgE espe-cífica a componentes antigênicos pôde ser visua-lizada. Os controles da reação (fig 2, linhas 7 e 8) bem como todos os resultados obtidos com as va-cinas 3 e 7 demonstraram ausência total de qual-quer reatividade antigênica.


Figura 2 - Caracterização dos componentes antigênicos das vacinas 2, 3 e 7 reconhecidos por anticorpos IgE séri-cos através de immunoblotting. Linhas 1, 2 e 3 (+) representam soros de pacientes asmáticos IgE positivos a D. pte-ronyssinus. Linhas 4, 5 e 6 (-) representam soros de indivíduos controles não atópicos. Linhas 7 e 8 (c) representam controles da reação, na ausência de anticorpos primários e secundário, respectivamente. Padrões de peso molecular são mostrados à esquerda (kDa).

Discussão

    O sucesso da IT depende do uso de vacinas de alérgenos de alta qualidade, adequadamente pa-dronizadas e fabricadas de forma consistente, isto é, produtos mais reprodutíveis para a terapia2. Há muita confusão sobre o significado da padroniza-ção neste contexto. Basicamente, padronização significa que toda vez que um novo lote de um produto é feito, dentro de certas especificações definidas, deve obedecer a um padrão interno. O ideal seria que estas especificações fossem uma propriedade do produto alergênico que está rela-cionada com ou responsável pela atividade tera-pêutica desejada. Se a reatividade da célula T é certamente responsável pelos efeitos terapêuticos das vacinas de alérgenos, então a reprodutibilida-de deveria ser medida para confirmar a consistên-cia entre os lotes. Porém, a avaliação do nível de reatividade da célula T de qualquer vacina é atu-almente impraticável; assim, outras propriedades imunológicas das vacinas podem ser utilizadas3.

    Os resultados deste estudo permitiram carac-terizar, pela primeira vez no Brasil, o perfil imu-noquímico de oito amostras de vacinas de alérge-nos contendo D. pteronyssinus procedentes de di-ferentes fornecedores utilizando vários procedi-mentos bioquímicos e imunológicos.

    Analisando o conteúdo de proteínas, o método de Lowry não se mostrou adequado para estas amostras de vacinas, sendo assim adotado o mé-todo de Bradford. Foi observada grande heteroge-neidade das vacinas comercialmente disponíveis, já que a maioria delas apresentou níveis extrema-mente baixos ou não detectáveis de proteína. Tal fato é de extrema relevância e preocupação, uma vez que os principais alérgenos derivados de D. pteronyssinus como Der p 1 e Der p 2 são de na-tureza protéica. Estes resultados de concentração protéica estão refletidos no perfil eletroforético obtido para as amostras de vacinas. Assim, as va-cinas 2, 3 e 4 foram as que apresentaram bandas protéicas em SDS-PAGE, tanto em número como em intensidade, diretamente proporcional à sua concentração protéica. Por outro lado, apesar do alto conteúdo protéico determinado na vacina 6, o seu perfil eletroforético não permitiu a identifica-ção de qualquer banda e sim forte marcação inde-finida (“arraste”), sugerindo a presença de outros componentes químicos. Cabe ressaltar que esta amostra foi novamente submetida à eletroforese em diferentes diluições (1:2, 1:4, 1:10, 1:50), e ainda assim não foram visualizadas definição de bandas (dados não mostrados). Dessa forma, utili-zando-se do método de antrona, foi evidenciado alto conteúdo de polissacárides na vacina 6, o que justificaria o tipo do perfil eletroforético obtido nessa amostra.

    Similarmente à análise da concentração pro-téica, altos níveis dos alérgenos Der p 1 e Der p 2 foram detectados somente na vacina 2 quando comparado aos obtidos para as demais vacinas. Os níveis de Der p 1 (409,9 mg/ml) determinados na vacina 2 foram similares aos valores máximos (faixa de 68 a 385 mg/ml; média de 172 ± 74 mg/ ml) encontrados por Nelson17 em análise de 28 vacinas de alérgenos contendo D. pteronyssinus disponíveis no mercado americano. Por outro la-do, as vacinas 3 e 7 apresentaram quantidades de Der p 1 (0,11 e 0,21 mg/ml ) extremamente inferi-ores aos limites mínimos relatados por este autor. Estes dados são de fundamental importância para o estabelecimento de doses de manutenção (7 a 12 mg de Der p 1) que têm sido efetivas em expe-rimentos clínicos controlados de imunoterapia conduzidos por Ewan et al18, Haugaard et al19 e Olsen et al20.

    Os resultados deste estudo indicam que as va-cinas de alérgenos comercialmente disponíveis no mercado nacional contendo D. pteronyssinus apresentam doses dos respectivos alérgenos muito aquém das doses recomendadas e comprovada-mente efetivas. Neste contexto, somente a vacina 2 poderia se enquadrar como apropriada para a imunoterapia.

Outro método atual de padronização para vaci-nas de alérgenos consiste na capacidade de detec-ção in vivo ou in vitro de anticorpos IgE específi-cos. Em nosso estudo, empregamos testes in vitro (ELISA e immunobloting) utilizando soros IgE positivos a D. pteronyssinus, de pacientes asmáti-cos, comprovados por testes cutâneos e ELISA frente a extratos alergênicos de referência (Bayer Corporation, EUA) comparado com soros contro-les negativos procedentes de indivíduos não ató-picos. Desta forma, foi possível evidenciar imu-norreatividade alergênica por ELISA-IgE somen-te em três amostras de vacinas, sendo que níveis de IgE significativos e comparáveis foram obti-dos apenas nas vacinas 2 e 3, apesar de serem de-tectados níveis extremamente baixos de Der p 1 e Der p 2 na vacina 3. Tal fato sugere a presença de outros alérgenos nesta vacina que apresentaram reatividade com anticorpos IgE. A especificidade da reação em todas as amostras de vacinas foi comprovada pela ausência total de reatividade frente a soros controles negativos. Por outro lado, immunoblotting IgE demonstrou padrão de reco-nhecimento antigênico somente com a vacina 2, denotando a presença de quantidades significati-vas de frações alergênicas na referida vacina, co-mo comprovado pelos resultados obtidos de con-centração protéica, perfil eletroforético e dosa-gem de alérgenos principais (Der p 1 e Der p 2). A fração protéica de 14 kDa reconhecida pelos três soros de pacientes asmáticos provavelmente corresponde ao principal alérgeno imunodomi-nante dos grupos 2 e 5 (Der p 2, Der p 5) de Der-matophagoides spp. O reconhecimento variável de outros componentes antigênicos reflete a mul-ti-sensibilização diferenciada de cada paciente pa-ra possíveis alérgenos de outros grupos presentes na vacina 2, como por exemplo, a fração de 25 kDa (grupo 1, Der p 6), 28-30 kDa (grupo 3), 54-60 kDa (grupo 4)21. Embora apresentando uma forte banda protéica na faixa de 54-60 kDa em SDS-PAGE, a vacina 3 não revelou qualquer pa-drão de reconhecimento antigênico por anticorpos IgE específicos em soros de pacientes asmáticos, sugerindo que a principal fração imunodominante que deve estar presente nas vacinas alergênicas de D. pteronyssinus seja os alérgenos dos grupos 2 e 5 (Der p 2 e Der p 5) de 14 kDa. Apesar dos re-sultados de ELISA para detecção de IgE específi-ca e immunoblotting IgE terem sido obtidos uti-lizando um número limitados de soros, estes re-fletem um perfil heterogêneo de reatividade das diferentes vacinas analisadas. Mesmo assim, estes dados podem não ser necessariamente verdadei-ros para todos os soros de pacientes alérgicos a D. pteronyssinus.

    Os resultados obtidos demonstram claramente que as vacinas alergênicas devem ser melhor ca-racterizadas quanto à potência total e ao teor do alérgeno principal, antes de serem colocadas no mercado. Desta forma, a consistência de cada lote pode ser monitorada com precisão, facilitando as comparações objetivas entre as vacinas alergêni-cas, uma vez que técnicas de ELISA baseada em anticorpos monoclonais específicos a diferentes alérgenos podem ser atualmente empregadas.

Finalmente, espera-se que este estudo seja de extrema utilidade para todos os alergistas brasilei-ros e médicos de outras especialidades que utili-zam imunoterapia em doenças alérgicas, bem co-mo fornecer diretrizes para o monitoramento da produção consistente de vacinas alergênicas de diferentes fornecedores. Com isto, os pacientes de todo o Brasil submetidos à imunoterapia com alérgenos deverão ser beneficiados com a obten-ção de melhores resultados, proporcionando as-sim maior credibilidade médica e popular da imunoterapia com alérgenos.

    Referências Bibliográficas

1.       Johansson SGO. New approaches to immunologic treatment of allergy [Editorial]. Allergy 1997;52: 601.

2.       Bousquet J, Lockey ZR, Malling HJ. Imunotera-pia com alérgenos: vacinas terapêuticas para doen-ças alérgicas. Informe da Organização Mundial da Saúde. Rev. bras. alerg. imunopatol. 2000;23:5-55.

3.       Wheeler AW, Drachenberg KJ. New routes and formulations for allergen-specific immunotherapy. Allergy 1997;52:602-612.

4.       Platts-Mills TAE, Mueller GA, Wheatley LM. Future directions for allergen immunotherapy. J. Allergy Clin Immunol 1998;102:335-343.

5.       Arruda LK, Rizzo MC, Chapman MD, Fernandez-Caldas E, Baggio D, Platts-Mills, TAE,  Naspitz CK. Exposure and sensitization to house dust mite allergens among asthmatic children in São Paulo, Brazil. Clin Exp Allergy 1991;21:433-439.

6.       Sopelete MC, Silva DAO, Arruda LK, Chapman MD, Taketomi EA. Dermatophagoides farinae (Der f 1) and Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1) allergen exposure among subjects living in Uberlândia, Brazil. Int Arch Allergy Immunol 2000;122:257-263.

7.       Smith AM, Yamaguchi H, Platts-Mills TAE, Fu SM. Prevalence of IgG anti-Der p 2 antibodies in children from high and low antigen exposure groups: Relationship of IgG and subclass antibody responses to exposure and allergic symptoms. Clin Immunol Immunopathol 1998; 86:102-109.

8.       Lowry OH, Rosebrough A, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol rea-gent. J Biol Chem 1951;193:265-275.

9.       Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-254.

10.  Martirani I, Hoxter G, Wajchenberg BL, Marian I, Cintra ABU. Determination of polyssacharide he-xoses and hexosamines in normal human sera. J Lab Clin Med 1959;54:773-779.

11.  Luczynska CM, Arruda LK, Platts-Mills TAE, Miller JD, Lopez M, Chapman MD. A two-site monoclonal antibody ELISA for the quantification of the major Dermatophagoides spp. allergens, Der p I and Der f I. J Immunol Methods 1989;118: 227-235.

12.  Mastrandrea F, Serio G, Minardi A, Coradduzza G, Maietta G, Iacobelli A, et al. IgE responses to Dermatophagoides pteronyssinus native major allergens Der p 1 and Der p 2 during long-term specific immunotherapy. Allergy 1997;52:1115-1119.

13.  Silva DAO, Gervasio AM, Sopelete MC, Arruda-Chaves E, Arruda LK, Chapman MD, et al. A sen-sitive reverse ELISA for the measurement of spe-cific IgE to Der p 2, a major Dermatophagoides pteronyssinus allergen. (submitted) 2000.

14.  Laemmli UK. Cleavage of structural proteins du-ring the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227,680-685.

15.  Blum H, Beier H, Gross HJ. Improved silver stai-ning of plant proteins, RNA and DNA in polya-crylamide gels. Electrophoresis 1987;8:93-99.

16.  Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: proceedure and some appli-cations. Proc Nat Acad Sci USA 1979;76:4350-4354.

17.  Nelson HS. The use of standardized extracts in allergen immunotherapy. J Allergy Clin Immunol 2000;106:41-45.

18.  Ewan PW, Alexander MM, Snape C, Ind PW, Agrell B, Dreborg S. Effective hyposensitization in allergic rhinitis using a pontent partially puri-fied extract of house dust mite. Clin Allergy 1998;18:501-508.

19. Haugaard L, Dahl R, Jacobsen L. A controlled do-se response study of immunotherapy with standar-dized, partially purified extract of house dust mite, clinical efficacy and side effects. J. Allergy Clin Immunol 1993;91:709-722.

20.  Olsen OT, Larsen KR, Jacobsen I, Svendsen UG. A 1 year, placebo-controlled, double-blind house-dust mite immunotherapy study in asthmatic adults. Allergy 1997;52:853-859.

21.  Platts-Mills TAE, Vervloet D, Thomas WR, Aal-berse RC, Chapman MD. Indoor allergens and asthma: Report of the Third International Work-shop. J Allergy Clin Immunol 1997; 100:S1-S24.

Endereço para correspondência:

Prof. Dr. Ernesto Akio Taketomi
Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas, Universidade de FeAvenida Pará, 1720 – Bloco 4C, Campus Umuarama
38400-902   -   Uberlândia   -   MG   -   Brasil.
Tel: 0XX-34-218.2195
Fax: 0XX-34-218.2333
E-mail: taketomi@ufu.brderal de Uberlândia

[Home Page SBAI] [Índice Geral] [Índice do Fascículo]


A Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia é publicação oficial da Sociedade Brasileira de Alergia e Imunopatologia.
Copyright 2001- SBAI -Av. Prof. Ascendino Reis, 455 - Sào Paulo - SP - Brasil - CEP: 04027-000